Estandarización de un protocolo para la rápida detección del Gen Bla-KPC en Bacterias Gramnegativas resistentes a Carbapenémicos mediante el uso de LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification)

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Title: Estandarización de un protocolo para la rápida detección del Gen Bla-KPC en Bacterias Gramnegativas resistentes a Carbapenémicos mediante el uso de LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification)
Authors: Alejandro Paspuezan, Ronny Ricardo
Advisor: Karolys Gutiérrez, Germania Margarita
Abstract: In Ecuador there is a high prevalence of bacteria carrying carbapenemase enzymes that represent the main mechanism of resistance against beta-lactam antibiotics, used in the treatment of respiratory infections, central nervous system, intra-abdominal, urinary, endocarditis and sepsis of unclassified origin. The gene coding for carbapenemases, bla-KPC-2, is the highest incidence in health institutions in the country, according to reports from the INSPI - CZ9, National Reference Center for Resistance to Antimicrobials (CNR-RAM). Currently hospitals or basic health centers lack a low cost nucleic acid amplification technique, rapid detection, high sensitivity, specificity and ability to discriminate resistance gene sequences. Through this research, a protocol for the rapid detection of the bla-KPC gene in Enterobacteria was standardized, using LAMP as a clinical diagnostic technique that can be used in hospitals and basic health centers in the future. 40 bacterial strains were selected from the CNR-RAM strain: 20 positive for bla-KPC; 11 strains with different resistance genes to carbapenemics (ESBL, bla-IMP, bla-NDM, bla-OXA-48, bla-Ctx-m) and 9 that did not present any resistance gene, all previously confirmed by microbiology and molecular biology. The amplification conditions of the bla-KPC gene region, which allowed to obtain a good quality amplicon were: temperature at 63 ° C, internal oligonucleotide concentrations: FIP / BIP 0.4 μM; MgSO 4 from 4mM; Betaine at 0.8M; dNTPs at 0.8mM; DNA volume 1μL; Amplification time was established in 60 minutes at the indicated temperature. LAMP presented a high sensitivity and specificity (> 99%).
Translated abstract: En Ecuador existe gran prevalencia de bacterias portadoras de enzimas carbapenemasas que representan el principal mecanismo de resistencia frente a los antibióticos betalactámicos, utilizados en el tratamiento de infecciones respiratorias, del sistema nervioso central, intraabdominales, urinarias, endocarditis y sepsis de origen no clasificado. El gen codificante para carbapenemasas, bla-KPC-2, es el de mayor incidencia en instituciones de salud del país, según reportes del INSPI – CZ9, Centro de Referencia Nacional de Resistencia a los Antimicrobianos (CNR-RAM). Actualmente hospitales o centros de salud básicos carecen de una técnica de amplificación de ácidos nucleicos de bajo costo, rápida detección, alta sensibilidad, especificidad y capacidad para discriminar secuencias de genes de resistencia. Mediante esta investigación se estandarizó un protocolo para la rápida detección del gen bla-KPC en Enterobacterias, usando LAMP como técnica de diagnóstico clínico que pueda ser utilizada a futuro en hospitales y centros de salud básicos. Se seleccionaron del cepario del CNR-RAM, 40 cepas bacterianas: 20 positivas para bla-KPC; 11 cepas con diferentes genes de resistencia a carbapenémicos (BLEE; bla-IMP; bla-NDM; bla-OXA-48, bla-Ctx-m) y 9 que no presentaban ningún gen de resistencia, todas confirmadas previamente mediante microbiología y biología molecular. Las condiciones de amplificación de la región del gen bla-KPC, que permitieron obtener un amplicón de buena calidad fueron: temperatura a 63 °C, concentraciones de oligonucleótidos internos: FIP/BIP 0.4μM; MgSO4 desde 4mM; Betaína a 0.8M; dNTPs a 0.8mM; volumen de ADN 1μL; tiempo de amplificación se estableció en 60 minutos a la temperatura indicada. LAMP presentó una alta sensibilidad y especificidad (>99%).
Keywords: BIOTECNOLOGÍA DE LOS RECURSOS NATURALEZA
CARBAPENEMASAS
ISOTÉRMICO
PIROFOSFATO
Issue Date: Feb-2019
URI: http://dspace.ups.edu.ec/handle/123456789/16949
Language: spa
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